Ditiotreitolo (DTT) estas ofte uzata redukta agento, ankaŭ konata kiel la nova verda aldonaĵo. Ĝi estas malgranda molekula organika kombinaĵo kun du merkaptanaj grupoj (-SH). Pro siaj reduktaj ecoj kaj stabileco, DTT estas vaste uzata en biokemio kaj molekulbiologiaj eksperimentoj.
La ĉefa rolo de DTT estas redukti disulfidajn ligojn en proteinoj kaj aliaj biomolekuloj. La disulfida ligo estas grava parto de proteina faldado kaj stabileco, sed sub certaj eksperimentaj kondiĉoj, kiel ekzemple reduktebla SDS-PAGE analizo, proteina rekombinado kaj faldado, necesas redukti la disulfidan ligon al du tiolaj grupoj por malimpliki la spacan strukturon de la proteino. DTT povas reagi kun disulfidaj ligoj por redukti ilin al merkaptanaj grupoj, tiel malfermante la spacan strukturon de la proteino kaj faciligante ĝian analizon kaj manipuladon.
DTT ankaŭ povas esti uzata por protekti enziman aktivecon kaj stabilecon. En iuj enzim-katalizitaj reakcioj, la aktiveco de la enzimo povas esti reduktita de la oksidanto. DTT povas reagi kun oksidantoj por redukti ilin al sendanĝeraj substancoj, tiel protektante la aktivecon kaj stabilecon de la enzimo.
Kompare kun tradiciaj reduktaj agentoj kiel β-merkaptoetanolo (β-ME), DTT estas konsiderata pli sekura kaj pli stabila redukta agento. Ĝi ne nur estas stabila en akva solvaĵo, sed ankaŭ konservas siajn reduktajn ecojn sub altaj temperaturoj kaj acido-bazaj kondiĉoj.
La uzo de DTT estas relative simpla. Ĝenerale, DTT estas solvita en taŭga bufro kaj poste aldonita al la eksperimenta sistemo. La optimuma koncentriĝo de DTT devas esti determinita laŭ la specifa eksperimento, kaj ĝi estas ĝenerale uzata en la intervalo de 0.1-1mM. Pli malaltaj koncentriĝoj povas redukti malfavorajn efikojn sur ĉelkresko kaj povas redukti citotoksecon pro troesprimo de celaj proteinoj. Pli altaj koncentriĝoj povas kaŭzi troan ĉelan metabolan ŝarĝon, influante ĉelkreskon kaj espriman efikecon.
La maniero determini la optimuman koncentriĝon povas esti taksi la esprimnivelon de la cela proteino per farado de IPTG-induktotestoj ĉe malsamaj koncentriĝoj. Malgrandskalaj kulturtestoj povas esti faritaj uzante gamon da IPTG-koncentriĝoj (ekz. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, ktp.) kaj la esprim-efiko ĉe malsamaj koncentriĝoj povas esti taksita per detektado de la esprimnivelo de la cela proteino (ekz. okcidenta makulego aŭ fluoreska detekto). Laŭ la eksperimentaj rezultoj, la koncentriĝo kun la plej bona esprim-efiko estis elektita kiel la optimuma koncentriĝo.
Krome, vi ankaŭ povas rilati al la koncerna literaturo aŭ la sperto de aliaj laboratorioj por kompreni la ofte uzatan IPTG-koncentriĝintervalon sub similaj eksperimentaj kondiĉoj, kaj poste optimumigi kaj alĝustigi laŭ la eksperimentaj bezonoj.
Gravas noti, ke la optimuma koncentriĝo povas varii depende de malsamaj esprimsistemoj, celproteinoj kaj eksperimentaj kondiĉoj, do plej bone estas optimumigi laŭkaze.
Resumante, DTT estas ofte uzata reduktanta agento, kiu povas esti uzata por redukti disulfidajn ligojn en proteinoj kaj aliaj biomolekuloj kaj por protekti enziman aktivecon kaj stabilecon. Ĝi estis vaste uzata en biokemio kaj molekulbiologiaj eksperimentoj.
Afiŝtempo: 28-a de septembro 2023