IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozido) estas analogo de β-galaktozidaza substrato, kiu estas tre induktebla. Sub la indukto de IPTG, la induktanto povas formi komplekson kun la represora proteino, tiel ke la formo de la represora proteino ŝanĝiĝas, tiel ke ĝi ne povas kombiniĝi kun la cela geno, kaj la cela geno esprimiĝas efike. Do kiel oni devus determini la koncentriĝon de IPTG dum la eksperimento? Ĉu ju pli granda, des pli bone?
Unue, ni komprenu la principon de IPTG-indukto: la laktoza operono (elemento) de E. coli enhavas tri strukturajn genojn, Z, Y kaj A, kiuj kodas β-galaktozidazon, permeazon kaj acetiltransferazon, respektive. lacZ hidrolizas laktozon en glukozon kaj galaktozon, aŭ en alolaktozon; lacY permesas al laktozo en la ĉirkaŭaĵo trapasi la ĉelmembranon kaj eniri la ĉelon; lacA transdonas la acetilan grupon de acetil-CoA al β-galaktozido, kio implicas forigon de la toksa efiko. Krome, ekzistas operacia sekvenco O, komenca sekvenco P kaj reguliga geno I. La I-geno kodas represorproteinon, kiu povas ligiĝi al la pozicio O de la operacia sekvenco, tiel ke la operono (meta) estas subpremita kaj malŝaltita. Ekzistas ankaŭ ligloko por la katabola genaktiviga proteino - CAP-ligloko antaŭ la komenca sekvenco P. La P-sekvenco, O-sekvenco kaj CAP-ligloko kune konsistigas la reguligan regionon de la lac-operono. La kodantaj genoj de la tri enzimoj estas reguligitaj de la sama reguliga regiono por atingi la kunordigitan esprimon de genproduktoj.
En la foresto de laktozo, la lac-operono (meta) estas en stato de subpremo. Tiam, la lac-represoro esprimita de la I-sekvenco sub la kontrolo de la PI-promotorsekvenco ligiĝas al la O-sekvenco, kio malhelpas RNA-polimerazon ligiĝi al la P-sekvenco kaj inhibicias transskriban komencon; kiam laktozo ĉeestas, la lac-operono (meta) povas esti induktita. En ĉi tiu operona (meta) sistemo, la vera induktanto ne estas laktozo mem. Laktozo eniras la ĉelon kaj estas katalizita de β-galaktozidazo por esti konvertita al alolaktozo. Ĉi-lasta, kiel induktantomolekulo, ligiĝas al la represorproteino kaj ŝanĝas la proteinan formon, kio kondukas al la disiĝo de la represorproteino de la O-sekvenco kaj transskribo. Isopropiltiogalaktozido (IPTG) havas la saman efikon kiel alolaktozo. Ĝi estas tre potenca induktanto, kiu ne estas metaboligata de bakterioj kaj estas tre stabila, tial ĝi estas vaste uzata en laboratorioj.
Kiel determini la optimuman koncentriĝon de IPTG? Prenu E. coli kiel ekzemplon.
La genetike modifita trostreĉo de *E. coli* BL21 enhavanta la pozitivan rekombinan pGEX (CGRP/msCT) estis inokulita en LB-likvan medion enhavantan 50μg·mL-1 Amp, kaj kultivita dumnokte je 37°C. La supre menciita kulturo estis inokulita en 10 botelojn da 50mL da freŝa LB-likva medio enhavanta 50μg·mL-1 Amp je proporcio de 1:100 por ekspansia kulturo, kaj kiam la OD600-valoro estis 0,6~0,8, IPTG estis aldonita al la fina koncentriĝo. Ĝi estas 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Post indukto je la sama temperaturo kaj la sama tempo, 1 mL de la bakteria solvaĵo estis prenita el ĝi, kaj la bakteriaj ĉeloj estis kolektitaj per centrifugado kaj submetitaj al SDS-PAGE por analizi la influon de malsamaj IPTG-koncentriĝoj sur proteina esprimo, kaj poste elekti la IPTG-koncentriĝon kun la plej granda proteina esprimo.
Post eksperimentoj, oni trovos, ke la koncentriĝo de IPTG ne estas tiel granda kiel eble. Ĉi tio estas ĉar IPTG havas certan toksecon por bakterioj. Superi la koncentriĝon ankaŭ mortigos la ĉelon; kaj ĝenerale parolante, ni esperas, ke ju pli da solvebla proteino esprimiĝas en la ĉelo, des pli bone, sed en multaj kazoj kiam la koncentriĝo de IPTG estas tro alta, granda kvanto da inkludo formiĝos. Korpo, sed la kvanto de solvebla proteino malpliiĝas. Tial, la plej taŭga IPTG-koncentriĝo ofte ne estas ju pli granda des pli bone, sed ju pli malalta la koncentriĝo.
La celo de indukto kaj kultivado de genetike modifitaj trostreĉoj estas pliigi la rendimenton de la cela proteino kaj redukti kostojn. La esprimo de la cela geno estas influata ne nur de la propraj faktoroj de la trostreĉo kaj la esprimplasmido, sed ankaŭ de aliaj eksteraj kondiĉoj, kiel la koncentriĝo de la induktanto, la induktotemperaturo kaj la induktotempo. Tial, ĝenerale, antaŭ ol nekonata proteino estas esprimita kaj purigita, estas plej bone studi la induktotempon, temperaturon kaj IPTG-koncentriĝon por elekti la taŭgajn kondiĉojn kaj akiri la plej bonajn eksperimentajn rezultojn.
Afiŝtempo: 31-a de decembro 2021